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La microscopia in campo oscuro è una tecnica che consente di esplorare il mondo nascosto di materiali e organismi trasparenti o semitrasparenti.
La fondamentale proprietà del campo oscuro è di poter osservare il campione “in vivo” e in un periodo di tempo prolungato, che permette di fare osservazioni dinamiche e non statiche del preparato. Quest’ultimo però una volta osservato, si deteriorerà irrimediabilmente in tempi variabili.
In questo articolo esploreremo i principi di funzionamento, la strumentazione utilizzata, le applicazioni, i vantaggi e i limiti di questa tecnica.
Cos'è la microscopia in campo oscuro?
È una tecnica di imaging che consente di visualizzare e studiare campioni trasparenti o poco riflettenti, che sarebbero difficili da osservare con altre tecniche di microscopia convenzionali. Il campo oscuro infatti sfrutta l’illuminazione obliqua con una configurazione anulare per generare immagini ad alto contrasto dei campioni. Si utilizza un cono di luce vuoto nel centro, che trasmesso attraverso un olio di opportuno indice di rifrazione, riesce a giungere ortogonalmente al preparato, delineando i profili dei componenti dello stesso.
Vediamo come ciò si realizza:
- illuminazione obliqua: la luce arriva al campione con un angolo acuto, che trova un olio a contatto del vetrino portaoggetti, il quale corregge ulteriormente la direzione del fascio luminoso incidente rispetto all’asse ottico del microscopio. Ciò rende visibili gli oggetti trasparenti o poco riflettenti, che altrimenti sarebbero indistinguibili su uno sfondo luminoso.
- Configurazione anulare: consiste nell’inserire un disco anulare opaco nel percorso della luce nel condensatore, che blocca la luce diretta proveniente dalla sorgente di illuminazione centrale, in questo modo vengono illuminati da tutte le direzioni del piano del vetrino. Quest’ultimo ha un olio con opportuno indice di rifrazione tra condensatore e vetrino portaoggetto, ma non dà luce che attraversa il preparato, consentendo solo alla luce diffusa o riflessa dagli oggetti del campione di passare attraverso l’obiettivo, che ha sovente la caratteristica di avere un iride regolabile per poter diminuire la luminosità, ma soprattutto per poter migliorare la profondità di campo.
Ciò permette che:
- si formi un’immagine che appare luminosa su uno sfondo scuro. Questo contrasto aiuta a visualizzare dettagli sottili e strutture che altrimenti sarebbero difficili da rilevare.
- Solo la luce diffusa o riflessa dagli oggetti del campione viene raccolta e visualizzata, mentre la luce diretta viene bloccata dal disco anulare opaco. Ciò permette di rilevare anche oggetti trasparenti che non emettono luce in modo significativo, ma rifrangono o deviano la luce incidente.
Inoltre è possibile modificare il contrasto e l’aspetto dell’immagine regolando la quantità di luce obliqua che incide sul campione: modificando l‘apertura numerica del condensatore, o chiudendo il diaframma dell’iride dell’obiettivo, oppure variando l’intensità della sorgente luminosa (interponendo degli iridi sul percorso del fascio, variando la temperatura di colore utilizzando filtri appropriati), o chiudendo il diaframma dell’iride dell’obiettivo, è possibile ottenere immagini con contrasto migliorato oppure regolare la luminosità dell’oggetto rispetto allo sfondo.
Strumentazione e configurazione
Possono variare in base alle specifiche esigenze, ma l’obiettivo principale è sempre poter visualizzare il campione trasparente con un contrasto elevato.
Della strumentazione fanno parte:
- Sorgente di luce: può essere una lampada alogena, a incandescenza o una sorgente di luce coerente come un laser. L’importante è che la luce sia sufficientemente brillante e regolabile in intensità. Inoltre una serie di diaframmi forati e calibrabili ottengono di tenere il fascio luminoso il più in fase possibile, per evitare sfocature dell’oculare o sul sensore della telecamera.
- Condensatore: è un componente che raccoglie e focalizza la luce proveniente dalla sorgente e la dirige verso il campione. Nel caso della microscopia in campo oscuro il condensatore ha un’apertura numerica più ampia rispetto a quella utilizzata nella microscopia convenzionale, in quanto un’importante componente della stessa è fermata dal disco anulare.
- Disco anulare: blocca la luce diretta proveniente dalla sorgente di illuminazione centrale e consente solo alla luce diffusa disposta a forma conica di giungere lateralmente al campione, che si trova tra il vetrino portaoggetto e coprioggetto, illuminando i contorni del campione. Permette quindi di passare attraverso l’obiettivo, per giungere poi all’oculare o al sensore della telecamera.
- Obiettivo: raccoglie la luce proveniente dal campione e forma l’immagine sul piano focale dell’oculare o della telecamera. L’obiettivo è scelto in base al potere di ingrandimento desiderato e all’apertura numerica necessaria per acquisire un’immagine di alta qualità.
- Oculare o telecamera: permettono all’utente di visualizzare e documentare le immagini ottenute. Nel caso di una telecamera, questa può essere collegata all’uscita del microscopio per acquisire immagini digitali.
per la ricerca di interessanti dettagli
La configurazione richiede alcune regolazioni per ottenere un’illuminazione obliqua ottimale e un buon contrasto dell’immagine, tra le quali:
- Regolazione dell’illuminazione: può richiedere l’uso di diaframmi o filtri per regolare la quantità di luce incidente sul campione.
- Messa a fuoco: in questo caso può essere particolarmente critica a causa del contrasto elevato. Si possono utilizzare le regolazioni di messa a fuoco fine disponibili sul microscopio per ottenere immagini nitide.
in un altro microscopio
- Preparazione del campione: i campioni devono essere trasparenti o poco riflettenti affinché l’illuminazione obliqua possa rivelarne i dettagli.
Applicazioni della microscopia in campo oscuro
La microscopia in campo oscuro trova applicazione in diversi settori scientifici e di ricerca, vediamo i principali.
Biologia cellulare e medicina
Nella biologia cellulare permette di osservare e studiare cellule vive in tempo reale senza la necessità di colorazioni o contrassegni.
Questo consente di studiare processi cellulari dinamici, come:
- la divisione cellulare,
- la migrazione cellulare,
- l’interazione tra cellule,
- i tempi e le modalità di degenerazione del preparato.
In campo medico può essere utilizzata per l’analisi di:
- campioni di sangue e plasma
- tessuti biologici,
- fluidi corporei come lacrime, sudore, urine, sperma, muco,
consentendo la visualizzazione di cellule o particelle trasparenti che potrebbero essere indicative di patologie o malattie.
Scienze dei materiali e nanomateriali
Viene utilizzata per lo studio di materiali trasparenti o poco riflettenti come:
- nanoparticelle,
- film sottili,
- cristalli,
- polimeri.
Questa tecnica infatti:
- consente di osservare a livello microscopico la struttura, la morfologia, le proprietà dei materiali;
- può essere utilizzata per l’analisi delle superfici dei materiali, permettendo di rilevare piccole irregolarità, difetti o caratteristiche superficiali difficili da visualizzare con altre tecniche di microscopia.
Nella ricerca sui nanomateriali e nella nanoscienza, la microscopia in campo oscuro consente di esaminare le caratteristiche e la morfologia di:
- nanoparticelle,
- nanotubi,
- nanofilamenti,
- altri oggetti a scala nanometrica.
Questo contribuisce alla comprensione delle proprietà e applicazioni dei nanomateriali.
Microbiologia e biotecnologia
Nella microbiologia è utile per l’osservazione di batteri, lieviti, parassiti e altri microrganismi trasparenti. Ciò permette di studiarne:
- la morfologia,
- il movimento,
- la struttura cellulare,
- le interazioni con l’ambiente circostante.
In biotecnologia viene utilizzata per:
- monitorare e caratterizzare la crescita e la vitalità delle cellule in colture cellulari,
- esaminare l’adesione cellulare su supporti o substrati,
- valutare l’efficacia di processi di ingegneria tissutale.
Vantaggi della microscopia in campo oscuro
Vediamo i vantaggi principali di questa tecnica:
- Contrasto: la microscopia in campo oscuro offre un contrasto elevato, consentendo di visualizzare dettagli sottili e strutture trasparenti che altrimenti sarebbero difficili da rilevare con altre tecniche di microscopia. Un buon set-up permette di osservare in vivo dettagli di 1\2 micron.
- Non richiede colorazioni: a differenza di altre tecniche di microscopia non richiede la colorazione o il contrassegno dei campioni, consentendo l’osservazione di campioni biologici vivi o non trattati.
- Imaging in tempo reale: grazie alla capacità di visualizzare campioni vivi senza danneggiarli permette l’osservazione di processi biologici e dinamici in tempo reale.
- Ampia gamma di campioni: può essere applicata a una vasta gamma di campioni trasparenti, tra cui cellule, tessuti, materiali e particelle nanometriche.
Limitazioni e sfide della microscopia in campo oscuro
Nonostante i numerosi vantaggi, la microscopia in campo oscuro presenta alcune limitazioni e sfide che è importante considerare:
- Dipendenza dal contrasto: se il campione non genera abbastanza contrasto, potrebbe risultare difficile distinguere dettagli sottili o strutture trasparenti.
- Ridotta profondità di campo: a causa dell’illuminazione obliqua e della configurazione anulare, la microscopia in campo oscuro può presentare una profondità di campo ridotta. Ciò significa che solo una sottile sezione del campione alla volta sarà a fuoco, rendendo difficile ottenere immagini completamente nitide su tutto il campione.
- Limitazioni nell’osservazione di campioni opachi o fortemente riflettenti: possono produrre un’elevata quantità di luce diffusa o riflessa, riducendo il contrasto dell’immagine o creando artefatti indesiderati.
- Sensibilità alla contaminazione e alle impurità: contaminanti come polvere, peli o particelle sospese possono ridurre la qualità dell’immagine o creare artefatti.
- Difficoltà nell’acquisizione di immagini digitali: sebbene possa essere collegata a una telecamera per l’acquisizione di immagini digitali, può essere difficile ottenere immagini di alta qualità a causa del basso contrasto e delle sfide legate alla profondità di campo. Si ricorda però che i sensori industriali a CCD di ultima generazione, riuscendo ad avere un’alta sensibilità, possono registrare immagini ben a fuoco grazie ad una migliorata profondità di campo ottenuta con luce monocromatica ad alta frequenza ben fasata da iridi sovrapposti.
- Requisiti di illuminazione e strumentazione specifici: richiede una configurazione sperimentale specifica e ciò può richiedere una strumentazione specializzata o la modifica di un microscopio ottico convenzionale.
- Limitazioni nelle dimensioni dei campioni: a causa delle caratteristiche dell’illuminazione obliqua può presentare limitazioni nella dimensione dei campioni che possono essere osservati. Campioni troppo grandi o spessi potrebbero non permettere alla luce di penetrare adeguatamente, compromettendo la qualità dell’immagine. Sui condensatori per campo oscuro infatti viene precisato lo spessore del vetrino adatto ad ottenere il risultato ottimale.
Microscopia in campo oscuro: cosa ricordare di questa tecnica?
La microscopia in campo oscuro rappresenta un importante strumento per l’esplorazione e la comprensione del mondo invisibile dei campioni trasparenti.
Mentre la microscopia ottica tradizionale ci permette di visualizzare campioni trattati e colorati attraverso la luce diretta, la microscopia in campo oscuro sfrutta un’illuminazione obliqua o trasversale che rivela dettagli e strutture in campioni vivi non trattati con tecniche coloranti che altrimenti sarebbero sfuggiti alla nostra osservazione. Questa tecnica offre un contrasto elevato, permettendoci di studiare in modo dettagliato le cellule, i materiali nanostrutturati e i microrganismi.
Per questo motivo questa tecnica ha trovato applicazioni in vari campi, tra cui la biologia cellulare, la medicina, le scienze dei materiali e la nanotecnologia.
I vantaggi principali di questa tecnica includono il contrasto, il non richiedere colorazioni, la capacità di osservare le immagini in tempo reale e il trovare applicazione per un’ampia gamma di campioni.
Allo stesso tempo ci sono delle limitazioni, come la dipendenza dal contrasto, una ridotta profondità di campo, la limitazione nell’osservazione di campioni opachi, la perdita del campione dopo l’osservazione, la sensibilità alle contaminazioni e dei requisiti specifici di illuminazione.
